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如何正確使用多孔細胞培養板進行細胞增殖實驗

發布日期: 2025-04-11
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   多孔細胞培養板(如6孔、12孔、24孔、96孔板等)是細胞生物學實驗中常用的工具,廣泛應用于細胞增殖、毒性測試、基因轉染等研究。正確使用多孔細胞培養板對實驗結果的準確性和可重復性至關重要。
 
  1.實驗前的準備
 
  (1)選擇合適的培養板
 
  多孔細胞培養板有不同的孔數和規格,需根據實驗需求選擇:
 
  -96孔板:適用于高通量篩選(如MTT、CCK-8檢測)。
 
  -24孔或12孔板:適用于中等規模實驗(如細胞遷移、轉染)。
 
  -6孔板:適用于較大規模培養(如蛋白提取、RNA提取)。
 
  (2)培養板的預處理
 
  -無菌處理:新開封的培養板可直接使用,若重復使用需嚴格滅菌(如紫外線照射或酒精浸泡后烘干)。
 
  -包被處理:某些貼壁細胞(如原代細胞、神經細胞)需提前用多聚賴氨酸、膠原或明膠包被,以增強細胞貼附。
 
  (3)細胞準備
 
  -選擇處于對數生長期的健康細胞。
 
  -用胰酶消化后,離心收集細胞,調整至適當密度(如1×10?~1×10?cells/mL,具體依細胞類型而定)。
 
  2.細胞接種
 
  (1)計算接種密度
 
  不同孔板的接種體積參考:
 
  -96孔板:每孔100-200μL(約5×10³~1×10?cells)。
 
  -24孔板:每孔0.5-1mL(約1×10?cells)。
 
  -6孔板:每孔2-3mL(約2×10?~5×10?cells)。
 
  (2)均勻接種
 
  -使用移液槍輕柔吹打細胞懸液,避免氣泡。
 
  -沿孔壁緩慢加入液體,防止細胞聚集在中央。
 
  -接種后輕搖培養板,使細胞分布均勻。
 
  (3)培養條件
 
  -將培養板放入37℃、5%CO?培養箱中。
 
  -接種后靜置2-4小時,待細胞貼壁后再移動培養板。
 
  3.細胞增殖檢測
 
  (1)顯微鏡觀察
 
  每日用倒置顯微鏡觀察細胞形態、貼壁情況及污染。
 
  (2)細胞計數法
 
  -使用臺盼藍染色法計數活細胞。
 
  -或采用自動細胞計數儀進行定量分析。
 
  (3)CCK-8或MTT法
 
  -CCK-8法:向每孔加入10%CCK-8溶液,孵育1-4小時后測450nm吸光度。
 
  -MTT法:加入MTT溶液(終濃度0.5mg/mL),孵育4小時,溶解甲瓚后測570nm吸光度。
 
  (4)EdU/BrdU標記
 
  通過DNA合成標記檢測增殖細胞,結合熒光顯微鏡或流式細胞術分析。
 
  4.實驗注意事項
 
  (1)避免污染
 
  -所有操作需在超凈臺中進行。
 
  -培養板開蓋時間盡量縮短,避免細菌或真菌污染。
 
  (2)邊緣效應
 
  -96孔板邊緣孔液體蒸發較快,可能導致數據偏差,可用PBS或培養基填充外圍孔以減少影響。
 
  (3)細胞均勻性
 
  -接種前充分混勻細胞懸液,避免細胞成團。
 
  -培養板放入培養箱時保持水平,防止液體分布不均。
 
  (4)數據重復性
 
  -每組實驗至少設3個復孔,提高數據可靠性。
 
  -使用同一批次培養板,減少批次差異。
 
  5.實驗結束后的處理
 
  -廢棄的培養液和細胞需經消毒處理(如84浸泡或高壓滅菌)。
 
  -一次性培養板按生物廢棄物處理,可重復使用的需清洗并滅菌。
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